臭氧抑制慢性压迫性坐骨神经损伤模型小鼠的脊髓Homer1b/c对神经病理性疼痛的影响

1上海交通大学医学院从属新华病院麻醉与重症医学科，上海 200082；2南京医科大学从属无锡人民病院麻醉科，无锡 214043；3徐州医科大学从属病院，徐州 221002

【论著】

本研究拟经由竖立小鼠慢性榨取性坐骨神经伤害（CCI）模型，商量臭氧对Homer1b/c引起的精神病理性痛苦（NP）的影响及相关机制。

1.1　实验动物

选择健康雄性昆明小鼠64只，8周龄，体重30~35 g。豢养情况：情况温度（24±2）℃、湿度（50±5）%、日夜节律正常、无强光或噪声、饮食自由，适应性豢养1周。按随机数字表法将小鼠分为8组（每组8只）：假手术组（S1组）、打针纯氧对照组（S2组）、CCI术后第7天组（C1组）、CCI术后第13天组（C2组）、术后第7天打针臭氧组（O1组）、术后第7~13天打针臭氧组（O2组）、鞘内打针反义寡核苷酸组（AS组）、鞘内打针生理盐水对照组（NS组）。S1组只游离神经不结扎，术后第7天观测机械缩足阈值（MWT）和热缩足隐蔽期（TWL）；S2组行左侧坐骨神经结扎，逐层缝合，在术后第7天打针纯氧2、4、8、24 h后观测MWT；C1组行左侧坐骨神经结扎，逐层缝合，术后第7天观测MWT和TWL，个中MWT观测时间点同O1组；C2组行左侧坐骨神经结扎，逐层缝合，术后第7~13天观测MWT和TWL；O1组行左侧坐骨神经结扎，逐层缝合，在术后第7天打针臭氧，观测打针后2、4、8、24 h的MWT和打针后2 h的TWL；O2组行左侧坐骨神经结扎，逐层缝合，在术后第7~13天天天打针臭氧后2 h观测MWT；AS组行左侧坐骨神经结扎，逐层缝合，在术后第4天起鞘内打针Homer1b/c的反义寡核苷酸至第7天，术后第4~9天观测MWT；NS组为AS组的生理盐水对照组，与AS组沟通时间点观测MWT。

1.2　小鼠CCI模型制备及干涉方式

参照文献介绍的方式制备小鼠CCI模型。腹腔打针1%戊巴比妥钠，麻醉不乱后将小鼠左侧进取，手术区域备皮消毒。于左股后缘纵向切开皮肤，钝性剥离股二头肌，用玻璃分针找到坐骨神经，星散四周组织游离神经骨干约5 mm，以距离1 mm的距离用4‑0缝线从外周向中枢偏向结扎三道，结扎强度以神经外膜轻度受压、坐骨神经支配区域肌肉轻度颤抖为宜。逐层缝合皮肤，瘦语进取置于笼中待麻醉完全清醒。术后7 d小鼠显现左后肢负重削减、挛缩等体征，且无肢体瘫痪、自噬等现象视为竖立模型成功，不然予以剔除。手术均由统一人员把持以包管结扎力度和神经伤害一致。

凭据临床治疗剂量使用1 ml打针器从臭氧机抽取20 mg/L臭氧0.5 ml，在瘦语处进针向手术偏向浸润打针。使用微量打针器进行鞘内打针0.3 ml Homer1b/c的反义寡核苷酸（5 mg/L）。

1.3　MWT检测

测试时间为天天08:00~10:00，测试时机为打针臭氧后2 h，在测定起头前1 h将小鼠置于ZH‑ZKL足底刺痛系统的金属丝网垫上，用10 cm×10 cm×5 cm的透气塑料框盖住，守候小鼠适应情况。测定过程要求四周情况恬静且所有把持由统一人员单盲完成。持针向上垂直刺激左后肢足底中部，迟缓持续施压，待小鼠显现抬足、舔足、快速甩足等逃避回响时，记录MWT。每只小鼠测量5次，每次距离3 min，去掉最大值与最小值后取剩余3次的平均值即为最终MWT。

1.4　TWL检测

使用ZH‑200热刺痛仪，设置强度为20%，珍爱时间为18 s。调整光源瞄准小鼠左后肢足底中部，打开热源赐与热刺激，仪器主动起头记录时间，当小鼠显现抬足、舔足等逃避回响后住手计时。每只小鼠反复测5次，每次距离5 min，去掉最大值与最小值后取剩余3次均值即为TWL。

1.5　Western blot法检测脊髓Homer1b/c、代谢型谷氨酸受体（mGluR）5表达水平

S1组、C2组、O2组、NS组和AS组小鼠在最后一次检测MWT后使用颈椎脱臼法悉数处死。凭据背根神经的终端判断脊髓节段，冰浴前提下掏出腰膨大，按中线取左侧脊髓到场RIPA裂解液冰浴下机械匀浆，静置30 min放入预冷的离心计，离心10 min后取上清液用BCA测Homer1b/c、mGluR5浓度。用10%星散胶进行SDS‑PAGE电泳，转膜，室温下5%脱脂牛奶关闭2 h，到场Home1b/c（1∶1 000）、mGluR5（1∶5 000）、β‑tublin（1∶5 000）一抗摇床4 ℃孵育留宿，第2天用三乙醇胺缓冲盐溶液漂洗3次，离别到场山羊抗鼠IgG（1∶2 000）和山羊抗兔IgG（1∶2 000）室温孵育2 h后再洗膜3次，滴加ECL发光液，暗室显影，以β‑tublin为内参照，用Image J软件对条带灰度进行剖析。以目的卵白灰度值与β‑tublin灰度值比值透露目的卵白水平。

1.6　免疫荧光法检测Home1b/c和mGluR5的分布与表达

S1组、C1组、O2组和AS组小鼠在最后一次检测MWT后使用颈椎脱臼法悉数处死。凭据背根神经终端判断脊髓节段冰浴掏出腰膨大，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后转移至梯度（10%、20%、30%）蔗糖溶液中脱水，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性夹杂物包埋冠状位一连冰冻切片，片厚6 mm，−20 ℃留存。每只小鼠随机遴选3张切片进行PBS漂洗3次，每次10 min，用0.5%TritonX‑100透化10 min，再次PBS漂洗3次，放入5%关闭液室温震动1 h。到场Home1b/c（1∶1 000）、mGluR5（1∶5 000）一抗4 ℃留宿，漂洗3次，离别到场异硫氰酸荧光素标记的驴抗兔二抗（1∶400）和驴抗鼠二抗（1∶400）室温避光孵育2 h，然后用4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚染色。荧鲜明微镜避光放大300倍视察摄影。

2.1　MWT及TWL检测究竟

与S1组对照，C1和C2组小鼠MWT及TWL均降低（P<0.05）；与C1组对照，O1组小鼠打针臭氧2 h后MWT升高（P<0.05）而TWL差别无统计学意义（P>0.05）；见图1。与C1组对照，O1组小鼠MWT在打针臭氧2、4 h后升高（P<0.05），但S2组小鼠MWT差别无统计学意义（P>0.05）；与C2组对照，O2组小鼠MWT升高（P<0.05）；与NS组对照，AS组小鼠MWT在术后第8、9天显著升高（P<0.05）；见图2

2.2　Western blot检测究竟

与S1组对照，C2组和O2组小鼠Homer1b/c表达水平升高（P<0.05）。与C2组对照，O2组小鼠Homer1b/c表达水平降低（P<0.05）。S1组、C2组、O2组小鼠mGluR5表达水平差别无统计学意义（P>0.05）。与S1组对照，NS组和AS组小鼠Homer1b/c表达水平升高（P<0.05）。与NS组对照，AS组小鼠Homer1b/c表达水平降低（P<0.05）。见图3、图4。

2.3　免疫荧光检测究竟

与S1组对照，C1组小鼠Homer1b/c的表达增多。与C1组对照，O2组、AS组小鼠Homer1b/c表达削减。S1组、C1组、O2组和AS组小鼠mGluR5表达在镜下未见显着差别。双重染色融合后，与S1组对照，C1组小鼠Homer1b/c表达位置与mGluR5的位置邻近。与C1组对照，O2组和AS组小鼠Homer1b/c表达位置与mGluR5邻近的究竟削减。见图5。

本研究发现，CCI模型小鼠在术后7 d显现机械痛敏和热痛敏行为后，脊髓Homer1b/c的表达显着增多，提醒Homer1b/c介入慢性榨取诱发的NP。CCI模型小鼠荧鲜明微镜下视察到脊髓中Homer1b/c与mGluR的连系较S1组增多，而臭氧干涉后小鼠的Homer1b/c表达、与mGluR的连系都被有效按捺，这或者是臭氧按捺脊髓Homer1b/c表达的感化。AS组小鼠鞘内打针Homer1b/c的反义寡核苷酸可以按捺Homer1b/c表达并增高MTW。

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国际麻醉学与苏醒杂志

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